Trombocytární indexy představují parametry charakterizující populaci krevních destiček získané rutinním hematologickým vyšetřením. Dynamika změn trombocytárních indexů vypovídá o aktivaci destiček, jejich tvorbě i utilizaci. V humánní medicíně našly uplatnění především jako biomarkery u septických pacientů, ale také při monitoringu pacientů se supresí kostní dřeně. Výsledky pilotních studií naznačují podobný potenciál trombocytárních indexů i u malých zvířat.
Trombocytární indexy představují panel laboratorních veličin charakterizující trombocyty z hlediska jejich velikosti, počtu a poměrného zastoupení v krvi. Většina z nich reflektuje jejich aktivaci, a to jak in vivo, tak in vitro.
Destičky, coby cytoplazmatické fragmenty megakaryocytů vznikající v kostní dřeni, se kromě tvorby primárního plaku při zástavě krvácení také podílejí na jeho následném odstranění a reparaci cévy, a to jak interakcí s leukocyty, tak endotelem. V místě cévního defektu dochází k jejich aktivaci, během které mění svůj tvar z diskoidálního na sférický, čímž zvyšují svůj povrch. Bioaktivní molekuly, které jsou skladovány uvnitř trombocytů v granulích, jsou následně vyloučeny do okolí. Z krevního řečiště jsou pak destičky odstraňovány během fyziologického udržování cévní integrity. Jejich samotná destrukce probíhá prostřednictvím makrofágů primárně ve slezině a játrech.
Právě změny, které nastávají v populaci destiček v souvislosti s jejich rolí v primární hemostáze, jsou reflektovány v dynamice TI. Recentní klinické i retrospektivní studie v humánní medicíně ukazují, že sledování dynamiky TI má zásadní význam u septických pacientů, včetně novorozenců, ale také při monitoringu pacientů se supresí kostní dřeně.
Ve veterinární medicíně bylo doposud publikováno pouze několik pilotních studií věnujících pozornost trombocytárním indexům (zejména střednímu objemu trombocytu a distribuční šíři trombocytů), např. u psů se septickou peritonitidou, na psím modelu endotoxemie nebo u psů infikovaných krevním parazitem Babesia rossi.
PLT – POČET TROMBOCYTŮ
Počet trombocytů vyjadřuje jejich kvantitu na jednotku objemu krve. Za fyziologických podmínek je množství trombocytů v krvi udržováno v rovnováze jejich neustálou produkcí a eliminací.
MPV – STŘEDNÍ OBJEM TROMBOCYTU
Střední objem trombocytu (MPV, mean platelet volume) se vyjadřuje ve femtolitrech (fl, femto = 10-15 l), představuje průměrnou velikost trombocytu vypočítanou z krevních částic, které byly analyticky identifikovány jako trombocyty. Parametr je analogem středního objemu erytrocytu (MCV, mean cell volume).
Vzhledem k tomu, že je MPV vyjádřen jako průměr, přítomnost příliš velkých, nebo malých destiček ve vzorku ovlivňuje jeho hodnotu. Výsledkem pak mohou být hodnoty v referenčním rozmezí i přes výskyt abnormálních trombocytů. V těchto případech je indikováno morfologické vyšetření krevního nátěru.
Mladé, nově vzniklé trombocyty jsou větší než maturované destičky, podobně jako jsou nezralé erytrocyty (retikulocyty) obvykle větší než zralé červené krvinky. Objem trombocytu souvisí s působením některých cytokinů (trombopoetinu, interleukinu-6, interleukinu-3), které regulují ploidii megakaryocytů a s ní spojenou produkci větších buněk. Je-li produkce trombocytů snížená, mladé trombocyty se stávají většími a aktivnějšími a hodnoty MPV se zvyšují. Zvýšený MPV indikuje zvětšení průměrného objemu trombocytární populace, tj. změnu, která může sloužit jako marker intenzity produkce a aktivace trombocytů. Ke zvýšení MPV však dochází i v důsledku samotné změny tvaru destiček během jejich aktivace (trombocyty se stávají sférické a formují se pseudopodia). Hodnoty MPV vyšší než 12 fl při paralelní trombocytopenii poukazují na normální až zvýšenou megakaryopoézu v kostní dřeni.
Zvýšený objem trombocytu reflektující aktivaci destiček poukazuje na existenci zánětového prostředí na základě úzké interakce mezi trombocyty a leukocytárním komplexem. Proto je MPV navrhován jako marker aktivace trombocytů u lidí se závažným systémovým zánětovým onemocněním. U psů se septickou peritonitidou byl zvýšený MPV během 24 hodin od stanovení diagnózy jediným změněným indexem spojeným se zvýšenou mortalitou. MPV by tak mohl sloužit jako klinicky významný parametr predikující mortalitu u septických pacientů podobně jako u lidí. Souvislost mezi nárůstem MPV a mortalitou však zatím nebyla zcela objasněna. Předpokládá se, že významnou úlohu sehrává právě rozvoj systémové zánětové odpovědi, v důsledku které se později rozvíjí multiorgánové selhání. Naproti tomu studie sledující změny TI u psů infikovaných Babesia rossi prognostický význam ve vztahu k mortalitě u žádného ze sledovaných TI neprokázala.
Hodnoty MPV jsou také ovlivněny plemennou predispozicí. U plemen Kavalír King Charles španěl a norfolkský teriér se fyziologicky vyskytuje zvýšené množství makrotrombocytů, což se projevuje nižším počtem destiček než u ostatních plemen, což je kompenzováno jejich větší velikostí. Tito pacienti mají tedy zvýšené hodnoty MPV i přes nižší hodnoty PLT.
Falešně zvýšené hodnoty MPV jsou často pozorovány u koček v souvislosti s pseudotrombocytopenií. Vzhledem k fyziologické odlišnosti kočičích a psích trombocytů lze předpokládat, že klinický význam TI bude ve felinní medicíně do značné míry limitován.
PDW – DISTRIBUČNÍ ŠÍŘE TROMBOCYTŮ
Parametr PDW (platelet distribution width) vyjadřuje odchylku v objemu trombocytů, jeho hodnoty narůstají v přítomnosti trombocytární anizocytózy. Vyjadřuje se ve fl. Větší velikost destiček zvyšuje PDW podobně, jako zvyšuje přítomnost makrocytů hodnotu distribuční šíře erytrocytů (RDW, red cell distribution width). Pro interpretaci je, podobně jako u ostatních indexů, nutné vyloučit přítomnost agregace.
V modelové studii sledující účinky endotoxinu na TI u psů byl pozorován nárůst hodnot PDW i MPV v první půlhodině o 28 %, resp. 45 %, přičemž oba parametry zůstaly zvýšené po dobu dalších 24 hodin. Zvýšení PDW a MPV souvisí pravděpodobně s vyplavením a zvýšenou produkcí větších a aktivnějších trombocytů v kostní dřeni, tj. obecným mechanismem reagujícím na periferní poškozování a konzumpci destiček.
PCT – DESTIČKOVÝ HEMATOKRIT
Hodnota PCT (plateletcrit, thrombocrit) se udává v l/l, vyjadřuje podíl trombocytární masy na objem krve. Hodnota PCT je získaná výpočtem z naměřených hodnot MPV a PLT, proto abnormality u některého z těchto parametrů mohou ovlivnit výslednou hodnotu PCT.
PCT (l/l) = PLT (×109/l) x MPV (fl) / 10000
Protože efektivita destičkového trombu souvisí pravděpodobně více s trombocytární masou než se samotným počtem destiček, doporučuje se pro zhodnocení primární hemostáze využít informace získané z hodnoty PCT, a to zejména při onemocněních spojených se zvýšeným MPV.
Na psím modelu endotoxemie byl zaznamenán paralelní pokles hodnot PLT a PCT (o 73 %, resp. 93 %) v první půlhodině po podání endotoxinu, přičemž tento výrazný pokles přetrvával i po dobu dalších 24 hodin (o 70 %, resp. 85 %). K dramatickému snížení PLT a PCT vede endotoxinem indukovaná adheze a následná agregace trombocytů zvýšeným uvolňováním trombocytárních agonistů a stimulace exprese adhezivních molekul na povrchu endotelových buněk.
Pokles hodnot PLT a PCT byl rovněž pozorován u pacientů infikovaných parazitem Babesia rossi, pozorované rozdíly však nebyly mezi přeživšími a nepřeživšími pacienty signifikantní.
Psy plemene Kavalír King Charles španěl a norfolkští teriéři mají v důsledku vrozené makrotrombocytózy hodnoty PCT v referenčním rozmezí navzdory nižší hodnotě PLT. Důvodem, jak již bylo zmíněno, je přítomnost velkých trombocytů, které způsobí, že celkový objem trombocytární masy zůstává konstantní.
P-LCR – PLATELET LARGE CELL RATIO
Zkratkou P-LCR označujeme podíl cirkulujících trombocytů s objemem ˃12 fl z celkového počtu trombocytů. Hodnota P-LCR identifikuje frakci největších trombocytů. Vyšší hodnoty P-LCR obvykle naznačují zvýšený počet nových mladých trombocytů. Parametr nabízí možnost monitoringu aktivity trombocytů, resp. trombopoézy.
IPF – FRAKCE NEZRALÝCH TROMBOCYTŮ
Frakce nezralých trombocytů, IPF (immature platelet fraction), vyjadřuje zastoupení mladých destiček, a to na základě odlišného obsahu nukleových kyselin v cytoplazmě. Nově tvořené trombocyty, nesoucí označení „retikulované trombocyty“, mají vyšší obsah RNA. Pro IPF se v literatuře používá rovněž zkratka r-PLT (reticulated platelet). Na rozdíl od aktivovaných trombocytů, se kterými sdílejí větší objem, obsahují nezralé trombocyty větší množství zbytkové RNA.
Hladina IPF vzrůstá s rostoucí tvorbou destiček v kostní dřeni, nízké hodnoty naopak indikují inhibovanou trombopoézu. Parametr IPF tak slouží primárně k zhodnocení efektivity produkce trombocytů v kostní dřeni. Při diferenciaci trombocytopenických stavů je konzumpce, resp. destrukce destiček provázena nepřetržitým uvolňováním mladých a velkých trombocytů z kostní dřeně za současného zvýšení hodnoty IPF. Pokud se jedná o funkční útlum kostní dřeně, k tvorbě a vyplavování nových destiček nedochází a hodnoty IPF zůstávají nízké.
Frakce nezralých destiček tak poskytuje prostor pro hodnocení úspěšnosti obnovy trombopoézy u pacientů se supresí kostní dřeně, např. po chemoterapii, resp. transplantaci kostní dřeně. V případě regenerace kostní dřeně se hodnoty IPF rychle zvyšují.
ÚSKALÍ MĚŘENÍ TROMBOCYTÁRNÍCH INDEXŮ
Trombocytární indexy se stávají dostupnými teprve s novými analytickými systémy. Z hematologických analyzátorů, jejichž výsledky jsou dostupné pro klienty ČR, jsou TI součástí vyšetření krevního obrazu u těchto veterinárních modelů: Nihon Kohden MEK-6550 Celltac Alpha, Siemens Advia 120, Sysmex XT-2000 iV nebo IDEXX ProCyte DX, resp. IDEXX LaserCyte DX.
Ve veterinární medicíně zatím objektivnější posouzení těchto citlivých markerů výrazně limituje nedostatek dat, která se navíc dál tříští pod vlivem řady faktorů. Nemá-li laboratoř stanoveny vlastní hodnoty, měly by být výsledky srovnávány pouze v rámci identických principů měření. Vhodnější než posouzení absolutních hodnot u jednotlivých TI se zdá být sledování dynamiky konkrétního indexu.
Kromě typu hematologického analyzátoru se na změnách TI, a to zásadním způsobem, podílí preanalytická fáze. Přesnost výsledků bývá nejčastěji ovlivněna agregací trombocytů, která se promítá zejména do celkového počtu trombocytů. Může však způsobit také falešný nárůst v množství velkých trombocytů a tím vzestup hodnot MPV a PDW.
Agregáty vznikají nejčastěji v důsledku aktivace trombocytů při odběru krve, při zacházení se vzorkem, nebo z důvodu samotné tendence trombocytů agregovat. Důvodem bývá odběr z příliš malé cévy, z cévy s pomalým tokem krvi, nebo z kolabující cévy při vzniku podtlaku. Použití jehel s malým průměrem, vysoký podtlak ve stříkačce nebo přílišné třepání při promíchávání vorků je rovněž spojeno se vznikem agregátů.
Shluky vznikají snadněji u koček, jejichž destičky jsou přirozeně větší. Proto se obecně doporučuje zacházet s kočičími vzorky co nejšetrněji a analýzu provést co nejrychleji po odběru. V optimálních podmínkách by měl být odběr proveden vpichem jehly do cévy a následným odkapáváním krve do zkumavky s antikoagulans.
Při sledování vlivu použitého antikoagulačního prostředku na výsledky TI bylo zjištěno, že až 82 % vzorků psí krve odebraných na citrát mělo nižší počty trombocytů ve srovnání se vzorky EDTA krve. Hodnoty MPV a PCDW byly podle očekávání signifikantně vyšší u citrátové krve. Citrát patrně častěji a intenzivněji iniciuje tvorbu agregátů než ETDA krev, a to jak u zdravých psů, tak u pacientů s neoplastickým onemocněním. Použití heparinu není obecně doporučováno ze stejného důvodu.
Naopak u koček studie hodnotící efekt shlukování trombocytů vlivem antikoagulans prokázala signifikantní zvýšení MPV a snížení MPC v krvi odebrané na EDTA ve srovnání s citrátovou krví. Kočičí trombocyty mají patrně větší sklon k formování agregátů v EDTA krvi než trombocyty psí. U koček proto lze, na rozdíl od psů, preferovat citrát před EDTA.